卢敏^1,2  白杰¹  魏凤仙¹  徐彬¹  尹清强²  李绍钰[1]^*

(1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2. 河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002)

摘  要：为了实现原核表达的途径高效获取抗菌肽蛋白，以RT-PCR的方法反转录合成家蝇的抗菌肽diptericin基因，并克隆至pGEX-4T-1载体上，转化至大肠杆菌BL21宿主菌进行表达。测序结果显示RT-PCR克隆到长345 bp的家蝇diptericin基因，重组菌经异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测到目的蛋白的融合表达，结果表明带有GST标签的融合蛋白大小约为37 KDa，并且通过GST纯化柱纯化得到了目的蛋白。

关键词：家蝇；抗菌肽；diptericin；原核表达

Expression of Diptericin Gene from Housefly(Musca Domestica) in E. coli

Lu Min^1,2  Bai Jie¹  Wei Fengxian¹    Xu Bin¹  Yin Qingqiang²  Li Shaoyu¹*

(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

Abstract: To expression antibacterial peptide by prokaryotic expression, diptericin gene was obtained by RT-PCR method from housefly. Then, diptericin gene was cloned to PGEX-4T-1 expression vector and transformed into E. coli BL21 for protein expression. Sequencing result showed that housefly diptericin gene was 345 nucleotides in length, recombinant PGEX-4T-1 was induced by IPTG and the expression of diptericin fusion protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western-blot. Result showed that diptericin fusion protein with GST label was about 37 KDa. And the diptericin fusion protein has been purified by GST protein purification column.

Keywords: housefly; antibacterial peptide; diptericin; prokaryotic expression

 

    抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物体内具有免疫屏障作用的一类多肽，是天然免疫系统中不可缺少的重要组成部分^[1]。自20世纪70年代末Boman等首次在惜古天蚕（Hyalopbora cecropia）中发现抗菌肽天蚕素（cecropin）以来，迄今已有1000多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定^[2]，且来源于昆虫的抗菌肽就有200多种。由于抗菌肽一般都具有抗细菌的活性，有的还具有抗病毒、抗原虫及抑制和杀伤肿瘤细胞等活性，并且具有热稳定性好、对正常细胞没有损害、不易产生耐药性等特点，所以成为人们关注的热点。

家蝇能够在恶劣的环境中生存，在其长期抵御微生物的侵袭中形成了其独特的免疫系统，对于家蝇抗菌肽的研究越来越多，其中研究较详细的有attacin、defensin、cecropin，而对双翅肽diptericin的研究较少。从昆虫体内提取天然抗菌肽的得率少，生产成本高，因此，构建基因工程菌来实现抗菌肽的高效表达成为人们研究的热点。本研究从家蝇幼虫体内克隆得到diptericin基因，与PGEX-4T-1载体连接后，在大肠杆菌BL21中得到表达，为后续筛选可以高效表达diptericin蛋白的基因工程菌提供基础。

 

1 材料与方法

1.1 实验菌株和试剂

    家蝇 Musca domestica 种蝇由河南省疾病预防控制中心惠赠，幼虫由本实验室饲养，饲养温度25℃，相对湿度50 % ~ 70 %；大肠杆菌DH5α、BL21购自天根生物生化科技有限公司，克隆质粒PMD19-T购自宝生物工程有限公司；大肠杆菌ATCC-25922和表达质粒PGEX-4T-1由本实验室保存。

GSTrap HP，1 ml 购自GE Healthcare Life Sciences，RNAiso Plus、M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、蛋白质分子量标准、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和DNA Marker为TaKaRa公司产品，质粒提取和DNA纯化回收试剂盒购自天根生物科技有限公司，其它试剂为国产和进口分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定由上海生物工程技术服务有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 家蝇幼虫总RNA的提取 微生物刺激家蝇：培养大肠杆菌ATCC-25922至OD 600=0.6~0.8，离心收集菌体，用生理盐水洗涤两次后重悬，最终OD 600=1.8~2.0。选取大小均一、活动能力强的家蝇3日龄幼虫，用带有大肠杆菌的针刺破家蝇幼虫后三分之一，饲养6 h后收集幼虫于液氮保存。总RNA提取：将幼虫于液氮研磨后，加入RNAiso Plus，提取总RNA（具体步骤按照RNAiso Plus试剂盒说明书），用1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并测定RNA浓度及纯度。

1.2.2 RT-PCR克隆家蝇抗菌肽diptericin基因 从GeneBank中查到家蝇diptericin基因mRNA序列（Genebank ID：FJ795370.1），在其编码区设计引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位点，下游引物引入XhoⅠ酶切位点，并加入27碱基的HA标签序列。

P1：5'-TTAGAATTCAACAAAATGAAATATCTCTGGGCCATTGTTC-3'

P2: 5'-TATCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCATCTGTAGGTATAA C-3'

以提取的总RNA为模板，用随机引物进行反转录合成cDNA第一链，反转录过程严格参照M-MLV反转录酶1st-strand cDNA合成的操作方法。以cDNA为模板，P1、P2为引物，扩增家蝇diptericin基因。PCR产物经纯化回收后，在T4 DNA连接酶作用下与PMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选方法筛选阳性克隆，具体方法参照《分子克隆实验指南》^[3]第15章。挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，鉴定后的阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司测序。

1.2.3 PGEX-4T-1-diptericin重组表达质粒的构建 将重组克隆PMD19-T-diptericin质粒和表达载体质粒PGEX-4T-1同时进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，并纯化回收diptericin基因和PGEX-4T-1质粒，回收产物经T4 -DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌BL21，利用转化子的AMP抗性在LB平板上进行筛选，阳性克隆进行质粒PCR鉴定及双酶切鉴定，并进行测序，确定有正确的阅读框，无碱基突变后进行下步实验。

1.2.4 diptericin基因的融合表达 从平板上挑取PGEX-4T-1-diptericin-BL21的单克隆菌落，接种于3 ml含有AMP的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天按照1:100接种于100 ml LB培养基中，培养至OD 600=0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h。离心收集菌体，在冰上进行超声破碎，条件：300 w，超声4 s，间隔4 s，10分钟。破碎之后离心收集上清液。将上清液与等体积的2×SDS上样缓冲液混合，沸水浴3~5 min，取8 μL进行SDS-PAGE电泳检测，以转化有空质粒PGEX-4T-1的大肠杆菌BL21为对照。SDS-PAGE蛋白电泳参照《分子克隆实验指南》第5章，蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色，使用的分离胶浓度为12 %。

1.2.5 Western-blot检测 目的蛋白中引入了HA标签，用此标签进行Western-blot检测目的蛋白，一抗：小鼠源 Anti-HA antibody，二抗：荧光素标记羊抗鼠IgG。经过SDS-PAGE电泳后，去除浓缩胶，照分离胶尺寸剪好滤纸和硝酸纤维素膜（NC膜），并将其与电转移装置配套的海绵垫置于转移缓冲液平衡10 min。安装好电转移装置后，冰浴条件下3 W转移1 h 50 min。将NC膜用封闭液封闭2h，一抗在室温下孵育1～2 h，二抗室温孵育1 h，用Odessey荧光WB检测系统扫描图片。

1.2.6 diptericin-GST融合蛋白的纯化 将重组PGEX-4T-1-diptericin-BL21大肠杆菌诱导表达后，离心取菌体沉淀进行超声破碎，取上清液用0.45 μm的过滤器进行过滤。按照GSTrap HP 1 ml纯化柱操作方法进行纯化，并进行SDS-PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 家蝇幼虫总RNA的提取与RT-PCR扩增diptericin基因

本试验用RNAiso Plus试剂提取家蝇幼虫总RNA，经电泳检测条带清晰完整性好，OD260/OD280在1.8~2.0之间纯度好，这为后续试验顺利进行奠定了基础。RT-PCR扩增diptericin基因，从电泳结果可以看出，扩增产物大小在350bp左右，与预计的结果相符，见图1。

1  2   3   4   M

600 450 300 150

bp 1200 900 750

 

图1 RT-PCR扩增diptericin基因

                      Fig.1 RT- PCR products of diptericin gene

注：M, DNA Marker; 1~4, diptericin 基因

 

2.2 重组菌PGEX-4T-1-diptericin-BL21的鉴定

提取阳性克隆质粒，进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，出现了大小约为4.9 kb和350 bp的两条带，表明重组质粒PGEX-4T-1-diptericin构建成功，见图2。将通过鉴定的质粒送至上海生物技术服务有限公司测序，分析测序结果，选取插入方向正确，具有正确的阅读框，无碱基突变的重组菌。测序结果显示，含有酶切位点及HA标签序列的diptericin基因长为345 bp，diptericin基因与Genbank中已公布diptericin序列的同源性最高达到99.9 %，对其编码蛋白进行分析，diptericin基因编码99个氨基酸，分子量约为10.796 kDa。

M      1     2

 

bp 600－ 450－ 300－ 150－

         图2 重组质粒PGEX-4T-1-diptericin双酶切鉴定

                                            Fig. 2 The double digestion results of PGEX-4T-1-diptericin

                            注：M, DNA Marker；1、2, 重组质粒PGEX-4T-1-diptericin双酶切

2.3 家蝇diptericin融合蛋白诱导表达及检测

     挑选重组PGEX-4T-1-diptericin-BL21的单菌落进行诱导表达，细胞破碎后提取上清，经过SDS-PAGE电泳，同时将大肠杆菌BL21和含有空质粒的大肠杆菌PGEX-4T-1-BL21作为对照，电泳结果如图3所示，目的蛋白为带有GST标签的diptericin蛋白，大约在37 KDa，与理论大小相符，而对照组此位置均无条带，PGEX-4T-1-BL21经诱导后在大小约为26 KDa处有明显条带，应为GST标签蛋白条带。

KDa 97.2 66.4   44.3     29.0     20.1

1   2   3   4   5   M

目的条带

                                  图3 重组diptericin基因表达产物SDS-PAGE电泳

                                       Fig.3 The SDS-PAGE of diptericin gene expression product

注：M, 蛋白分子质量标准; 1, 大肠杆菌BL21; 2, 大肠杆菌PGEX-4T-1-BL21; 3, 大肠杆菌PGEX-4T-1-BL21诱导上清; 4, PGEX-4T-1-diptericin-BL21未诱导上清; 5, PGEX-4T-1-BL21诱导表达破碎上清

2.4  Western-blot检测

从图4可以看出，通过HA抗体进行Western-blot检测，PGEX-4T-1-diptericin-BL21诱导后有单一条带的目的蛋白，而对照组PGEX-4T-1-BL21无条带，表明diptericin基因成功在大肠杆菌BL21中得到了表达。

 

 

 

75KDa 63KDa 48KDa 35KDa   25KDa 20KDa

M   1   2

          图4 重组diptericin蛋白western-blot检测

     Fig.4 The western-blot of diptericin

                              注：M, 蛋白分子质量标准; 1, 大肠杆菌PGEX-4T-1-BL21; 2, PGEX-4T-1-diptericin-BL21

 

2.5重组蛋白纯化

收集PGEX-4T-1-diptericin-BL21诱导表达后的菌体超声破碎上清，通过GSTrap HP 1 ml纯化柱纯化目的蛋白，将洗脱缓冲液洗脱后的样品进行SDS-PAGE电泳检测，见图5，可以看到，通过GST纯化柱纯化到了目的蛋白，显示为单一条带，大小约37 KDa。

M  1  2

97.2 KDa 66.4 KDa   44.3 KDa     29.0 KDa

 

 

  图5 重组diptericin蛋白的纯化

Fig.5 Purification of diptericin

                            注：M, 蛋白分子质量标准; 1-2, diptericin-GST融合蛋白纯化

 

3 讨论

已有许多学者对构建基因工程菌来生产抗菌肽进行了研究，包括原核表达和真核表达，如Liang等^[4]利用将家蝇Cecropin基因克隆到PGEX-4T-1载体上，实现了其在大肠杆菌中的融合表达，切除GST标签后的Cecropin蛋白对大肠杆菌具有一定的抑菌效果，李小波^[5]等将家蝇抗菌肽attacin克隆至酵母表达载体pPIC9K中，实现其在毕赤酵母GS115中的表达。双翅肽(diptericin)最早由Dimarcq等^[6]从经细菌诱导的新陆原伏蝇Phormia terranovae 幼虫的血淋巴中分离得到，并证实其参与昆虫的体液免疫防御且发挥着十分重要作用。然而，对于家蝇diptericin基因的研究并不多。

抗菌肽对蛋白酶非常敏感，而且表达抗菌肽对宿主菌可能具有毒性或者表达的抗菌肽无活性^[7]，以融合蛋白的形式表达抗菌肽目的基因，可以减少抗菌肽本身对宿主菌的毒害作用，同时还能保护抗菌肽蛋白避免蛋白酶的降解^[8]。PGEX-4T-1是目前较多使用的表达载体，它利用谷胱甘肽S-转移酶基因和目的基因连接，能够在大肠杆菌中产生GST融合蛋白，并且可以用凝血酶进行切割GST蛋白而获得目的基因产物。徐建华^[9]等将家蝇Attacin基因分别克隆至原核表达载体pET30a(+)和pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌，从pET30a(+)/Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白，而从pGEX-4T-1/Attacin重组质粒转化菌种获得了GST-Attacin融合蛋白。舒梅^[10]等将水生动物抗菌肽Y18和CEC1分别克隆到pGEX-4T-1载体上，构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体，获得了抗菌肽Y18和CEC1，并发现融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生长。

因此，本研究将家蝇diptericin基因克隆至PGEX-4T-1载体中，对重组大肠杆菌进行IPTG诱导，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测到大小约为37 KDa的目的蛋白，western-blot也检测到单一蛋白条带，说明diptericin基因在大肠杆菌中进行了融合表达。经过纯化，得到了含有GST标签的diptericin融合蛋白，以融合蛋白形式表达的diptericin蛋白对宿主菌没有明显的抑制生长作用，后续试验将通过切除GST标签来检测diptericin蛋白的生物活性，并通过研究不同诱导时间、温度等条件来改善目的基因的表达，以期筛选到可以高效表达diptericin蛋白的重组基因工程菌。

抗菌肽有不同的种类，通过将不同的抗菌肽串联进行表达有望得到活性更高的杂合抗菌肽，如陈玉海^[11]等将非洲爪蟾皮肤分泌的两种种抗菌肽magaininⅡ和PGLa在毕赤酵母中进行杂合表达，构建了杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体，实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。因此，今后可将不同的家蝇抗菌肽基因进行串联表达，获得抗菌谱更广，活性更好的基因工程抗菌肽蛋白。

4 结论

本研究成功构建了家蝇diptericin基因原核表达载体PGEX-4T-1-diptericin-BL21，在大肠杆菌BL21中获得了该蛋白的可溶性表达，经过GST标签纯化柱纯化得到了diptericin蛋白，为高效表达该蛋白提供了前期基础。

参考文献

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